01050000474

0
5
10
15
20
25
Nồng độ đường huyết
(mmol/l)
0h 48h 72h 7 ngày 10 ngày 14 ngày
Thời gian
HFD+STZ
HFD+ đệm
ND+STZ
ND+đệm
1.42
0.62
0.78
0.57
1.80
0.20
0.60
0.52
1.00
0.57
0.60
0.15
1.22
1.40
1.38
1.10
0.20
1.00
0.58
1.00
0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
con chuột
nồng độ insulin (ng/ml)
35,01±3,03g, tăng gần 2 lần so với thời điểm ban đầu. Hình 3.2 là ảnh hai con chuột nuôi béo
(HFD) và nuôi bình thường (ND).














Xác định các chỉ số mỡ máu: cholesterol toàn phần, triglyceride, HDLc, LDLc. Chỉ số
triglyceride ở 5 cá thể nhóm HFD tăng đáng kể (tăng 139,31%) và có ý nghĩa so với 5 cá thể nhóm
ND (p<0,001). Tương tự như vậy, chỉ số cholesterol ở 5 cá thể thuộc nhóm HFD cao hơn so với
nhóm ND (hơn 30,3%) và sự khác biệt có ý nghĩa thống kê, p<0,05. Hai chỉ số HDLc và LDLc tuy
có sự khác biệt nhưng là hoàn toàn ngẫu nhiên, không có ý nghĩa thống kê.
3.2.1.2. Định lượng đường huyết và insulin của chuột nhắt béo sau tiêm màng bụng STZ
Chúng tôi đã ứng dụng mô hình của Sawant và tập thể, nhóm chuột HFD tiêm màng bụng (tmb)
STZ liều 120mg/kg (HFD+STZ) được so sánh với ba nhóm HFD tmb đệm (HFD+đệm), ND tmb
STZ (ND+STZ), ND tmb đệm (ND+đệm). Kết quả định lượng đường huyết của các nhóm chuột thể
hiện trên Hình 3.3. Nồng độ đường huyết nhóm ND+STZ tăng dần đến 18,89±0,04 mmol/l tại 72
giờ, sau đó lại giảm dần sau 7 ngày, 10 ngày, 14 ngày lần lượt là:13,59±0,59, 8,65±0,57, 8,84±0,4
mmol/l. Với nhóm HFD+STZ nồng độ đường huyết tại các thời điểm này rất cao, tương ứng là:
22,53±1,12, 23,24±2,29, 22,96±2,47, 23,2±1,86 mmol/l, sự tăng đường huyết ở nhóm này được duy
trì khá ổn định, (p<0,001).
Các con chuột HFD+STZ có nồng đô
̣
đươ
̀
ng huyết cao (trên 18 mmol/l) được định lượng
insulin (Hình 3.5). Với những con có nồng đô
̣
insulin nằm trong khoa
̉
ng 0,5 - 2 ng/ml là chuột ĐTĐ
type 2. Kết quả chúng tôi đã gây được 17/20 con chuô
̣
t ĐTĐ type 2, hiê
̣
u suất đa
̣
t 85%.











Hình 3.2. Chuột nuôi HFD (bên trái) và chuột nuôi ND (bên phải)

Hình 3.3. Nồng độ đƣờng huyết của các lô
chuột thí nghiệm
tại các thời điểm

Hình 3.5. Định lƣợng nồng độ insulin máu
chuột
HFD + STZ

3.2.1.4. Nghiệm pháp dung nạp glucose
Tại thời điểm 1 giờ sau khi uống dung dịch đường, đường huyết của các chuột đều tăng lên,
tăng nhiều nhất là nhóm HFD+STZ, tăng lên gần 30%. Tại thời điểm 2 giờ, trong khi ba nhóm
chuột đối chứng đường huyết đã giảm dần về gần mức bình thường, nhóm chuột HFD+STZ lại có
xu hướng tăng đường huyết. Khả năng dung nạp glucose của nhóm chuột HFD+STZ đã giảm đi,
khẳng định chuột đã bị ĐTĐ type 2. Kết quả trình bày trên Bảng 3.4.
Bảng 3.4. Khả năng dung nạp glucose của các nhóm chuột
0 giờ
(mmol/l)
1 giờ
(mmol/l)
2 giờ
(mmol/l)
HFD + STZ 23,20±1,86 30,04±1,23
I*, II**
29,95±1,44
I*,II**
HFD + đệm 8,81±0,34 11,20±1,20 9,25±1,1

ND + STZ 8,84±0,40 12,82±0,87 9,8±0,82
ND + đệm 6,09±0,46 6,33±1,30 6,04±1,12
(n=5, I so với chuột cùng nhóm thời điểm 0 giờ, II so với chuột ở các nhóm đối chứng ở cùng
thời điểm,
*
p<0,05,
**
p<0,001 )
3.2.2. Sàng lọc các mẫu thực vật có khả năng hạ đƣờng huyết
Cho chuột nhắt ĐTĐ type 2 uống CNN và CC các mẫu thực vật với liều 500 mg/kg/ngày. Có 4
đợt thí nghiệm, mỗi đợt điều tra hoạt tính hạ đường huyết của 6 mẫu thực vật. Các Hình 3.6, 3.7,
3.8, 3.9 thể hiện kết quả định lượng nồng độ đường huyết của chuột tại thời điểm 0 giờ và 20 ngày
qua các đợt thí nghiệm.

















Tại đợt I, trong số 6 mẫu thực vật được thử nghiệm khả năng hạ đường huyết chỉ có duy nhất
mẫu chè đắng thể hiện hoạt tính, cụ thể: chuột uống CNN đường huyết hạ 65%, chuột uống CC hạ
64% (p<0,001) so với thời điểm 0 giờ. Cụ thể nồng độ đường huyết của nhóm chuột ĐTĐ type 2 cho
uống CNN lá chè đắng tại ngày thứ 20 là 8,3±0,5 mmol/l, nhóm uống CC lá chè đắng là 8,7±0,8 mmol/l.
Hình 3.6. Đƣờng huyết của chuột ĐTĐ type 2
cho uống cao chiết thực vật đợt I


















Tại đợt II, đã phát hiện ra khả năng hạ đường huyết của mẫu thân, lá chó đẻ răng cưa, chuột uống CNN hạ
63%, chuột uống CC hạ 44% (p<0,001) và mẫu củ chuối hột, chuột uống CNN hạ 58%, chuột uống CC hạ
55% (p<0,001). Các con chuột sau khi cho uống cao chiết hoàn toàn khỏe mạnh và không xuất hiện các biến
chứng của bệnh ĐTĐ.

















Nhận thấy trong đợt III chỉ có duy nhất mẫu lá dây thìa canh thể hiện hoạt tính hạ đường huyết.
Chuột uống CNN đường huyết hạ 60%, chuột uống CC hạ 53% (p<0,001). Kết quả nghiên cứu của
chúng tôi về hoạt tính hạ đường huyết của dây thìa canh Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br.ex Schult
hoàn toàn phù hợp với kết luận của một số tác giả trong và ngoài nước. Khác với nhóm tác giả Trần
Văn Ơn cho chuột bình thường và chuột tăng đường huyết bởi STZ uống dịch chiết dây thìa canh
Hình 3.7. Đƣờng huyết của chuột ĐTĐ type 2 cho uống cao chiết thực vật
đợt II
Hình 3.8. Đƣờng huyết của chuột ĐTĐ type 2 cho uống cao chiết thực
vật đợt III
trong một thời gian ngắn (tính theo giờ), chúng tôi đã cho chuột nhắt ĐTĐ type 2 uống dịch chiết
trong 20 ngày, thấy rằng cao chiết lá dây thìa canh có tác dụng hạ đường huyết ổn định trong một thời
gian dài.


















Với đợt điều tra cuối cùng, chúng tôi đã thu được 4 mẫu có tác dụng hạ đường huyết. Mẫu lá tầm
gửi trên cây mít: chuột uống CNN hạ 60%, chuột uống CC hạ 64% (p<0,001). Mẫu nụ vối: chuột
uống CNN hạ 60%, chuột uống CC hạ 56% (p<0,001). Mẫu lá vối: chuột uống CNN hạ 67%, chuột
uống CC hạ 63% (p<0,001). Mẫu vỏ thân ổi: chuột uống CNN hạ 52%, chuột uống CC hạ 48%
(p<0,001).
Đã có nhiều công bố về tác dụng hạ đường huyết của lá và quả ổi Psidium gajava Linn. Đối với
vỏ thân ổi, những công bố nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết trên thế giới còn rất ít và hiện chưa có tại
Việt Nam. Hoạt tính hạ đường huyết của 3 mẫu lá tầm gửi trên cây mít, lá vối, nụ vối gần tương
đương nhau. Chúng tôi điều tra nụ vối dựa trên những kết quả công bố trong và ngoài nước, đây là một
nguồn thực vật vô cùng dồi dào tại nước ta. Nhằm làm phong phú thêm về tác dụng của cây vối, chúng tôi
lựa chọn và tập trung nghiên cứu lá vối, vì so với nụ vối, lá vối được thu hái dễ dàng hơn, hoạt tính hạ
đường huyết thể hiện tương đương nụ vối trong khi các công bố về tác dụng và cơ chế hạ đường huyết của
chúng còn khá ít ỏi.
Sau khi điều tra 24 mẫu thực vật, đã xác định được 8 mẫu có tác dụng hạ đường huyết trên
chuột ĐTĐ type 2: lá chè đắng, thân và lá chó đẻ răng cưa, dây thìa canh, nụ vối, củ chuối hột, lá
tầm gửi trên cây mít, lá vối, vỏ thân ổi. Nhận thấy tầm gửi trên cây mít là đối tượng nghiên cứu hoàn
toàn mới, đây là công bố đầu tiên về tác dụng hạ đường huyết của Macrosolen cochinchinensis (Lour.)
Blume trên thế giới.
3.3. NGHIÊN CỨU DỊCH CHIẾT LÁ VỐI VÀ LÁ CHÈ ĐẮNG
3.3.3. Ảnh hƣởng của cao nƣớc lá vối, lá chè đắng lên gan chuột
3.3.3.1. Các chỉ số GOT, GPT máu chuột
Hình 3.9. Đƣờng huyết của chuột ĐTĐ type 2 cho uống cao chiết thực
vật đợt IV
Bên cạnh nghiên cứu xác định hoạt tính hạ đường huyết của các cao chiết phân đoạn chúng tôi
đã theo dõi và xác định các chỉ số men gan, tạo tiêu bản đúc cắt gan chuột. Kết quả thể hiện trên
Hình 3.10 và 3.11













Chuột ĐTĐ type 2 không được cho uống cao chiết lá vối, lá chè đắng có biểu hiện gan bị
tổn thương, chỉ số men gan khá cao, chỉ số GOT trung bình là 59±5,2U/l, GPT trung bình là
100±6,8U/l. Trong khi đó các con chuột ĐTĐ type 2 cho uống cao nước lá vối và lá chè đắng các
chỉ số men gan đã hạ thấp hơn so với nhóm chuột đối chứng, tuy vẫn cao hơn nhóm chuột bình
thường. Nhóm chuột ĐTĐ type 2 cho uống cao nước lá vối có GOT, GPT trung bình tương ứng là
31,6±4,3 và 42,4±5,1U/l, nhóm chuột ĐTĐ type 2 cho uống cao nước lá chè đắng có GOT, GPT
trung bình tương ứng là 29,4±2,8 và 35±3,7 U/l, điều này chứng tỏ gan có dấu hiệu được phục hồi.
3.3.3.2. Ảnh hưởng lên cấu trúc mô gan
Từ những hình ảnh quan sát tiêu bản gan chuột ĐTĐ type 2 không cho uống cao chiết thực
vật, các tế bào gan méo mó, rời rạc, hình dạng tế bào không rõ rệt, thiếu sự liên kết với nhau, xuất
hiện một số tế bào bị teo nhân, kích thước nhỏ hơn so với các tế bào khác. Nhân tế bào bắt màu rất
đậm chứng tỏ tế bào đã bị chết. Ở tiêu bản gan chuột ĐTĐ type 2 cho uống cao nước lá vối và lá
chè đắng, hình ảnh tế bào quan sát nét hơn, dường như không nhận ra sự phá hủy của tế bào, nhân
tế bào cũng như các tế bào có kích thước bình thường và khá đồng đều, nhân tế bào bắt màu hoàn
toàn bình thường, đồng thời các tế bào liên kết với nhau, tương đương với tiêu bản gan chuột nhắt
bình thường.












Hình 3.10. Giá trị các chỉ số GOT, GPT trong máu chuột

100±6.8
59±5.2
42.4±5.1
31.6±4.3 35±3.7
29.4±2.8
20±1.5
37±2.7
0
30
60
90
120
GOT GPT
Nồng độ (U/l)
Chuột ĐTĐ type 2 Chuột bình thường
Chuột ĐTĐ type 2+cao nước lá vối Chuột ĐTĐ type 2+cao nước lá chè đắng































3.3.2. Cao chiết phân đoạn lá vối
3.3.2.1.Khối lượng cao chiết phân đoạn lá vối
Chúng tôi sử dụng 3kg bột khô lá vối, chiết bằng nước nóng thu CNN, sau đó tách chiết phân
đoạn qua các dung môi. CNC chiếm tỷ lệ lớn nhất (31%), sau đó là CBuOH (26,6%), CEtA (22%)
và thấp nhất là CHe (13,3%). Các chất không phân cực chiếm tỷ lệ khá ít so với nhóm chất phân
cực trung bình và phân cực mạnh.
3.3.2.2. Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của các phân đoạn dịch chiết lá vối
Hình 3.12 là kết quả tổng hợp nồng độ đường huyết sau 20 ngày cho chuột uống các cao chiết
phân đoạn lá vối liều 500mg/kg.




Hình 3.11. Hình ảnh quan sát tiêu bản đúc cắt gan chuột
Bên trái: chụp ảnh độ phóng đại 400 lần, bên phải: phóng đại 1600 lần
Gan chuột ĐTĐ
type 2 cho uống cao nước lá vối
Gan chuột ĐTĐ
type 2 cho uống cao nước lá chè
đắng
Gan chuột ĐTĐ type 2
Gan chuột bình thường












Trước thời điểm 7 ngày, nồng độ đường huyết của các lô chuột được điều trị bằng các cao chiết
phân đoạn lá vối tuy có sự khác biệt nhưng không có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Sau 7 ngày, một số
cao chiết lá vối thể hiện hoạt tính hạ đường huyết khá rõ như CHe, CEtA và CBuOH (p<0,05).
Hoạt tính này thể hiện càng rõ tại thời điểm 20 ngày khi p<0,01. Sở dĩ chúng tôi kéo dài thời gian
thí nghiệm khi cho chuột nhắt điều trị trong 20 ngày để xác định hoạt tính hạ đường huyết của chế
phẩm có ổn định hay không. CHe tuy chiếm tỷ lệ thấp nhất nhưng thể hiện hoạt tính hạ đường
huyết, nồng độ đường huyết trung bình của chuột sau 20 ngày điều trị bằng 6,1±0,7 mmol/l, tiếp
theo là CEtA (6,8±1,1mmol/l) và CBuOH (9,3±1,7mmol/l). Phân đoạn CNC cũng có tác dụng hạ
đường huyết tuy rằng chưa thật sự hiệu quả (nồng độ đường huyết sau 20 ngày điều trị bằng
15,2±1,3 mmol/l). Lựa chọn CHe, CEtA, CBuOH để xác định thành phần hóa học.
3.3.2.3. Hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase của các cao phân đoạn
CHe có khả năng ức chế enzym α-glucosidase với IC
50
là 5,037±0,6 μg/ml, đồng nghĩa với
lượng đường glucose bị hạn chế tạo ra nhiều nhất, do đó nồng độ đường huyết giảm nhiều nhất. CEtA
cũng có khả năng ức chế α-glucosidase gần như tương đương với CHe, IC
50
là 5,766 ± 0,3 μg/ml.
Cuối cùng là CBuOH có IC
50
cao hơn, 8,011 ± 0,7 μg/ml.
3.3.2.3. Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất của lá vối
a.  - Sitosterol hay stigmast-5-en-24R-3-ol
Đưa lên cột 15 g CHe. Rửa giải cột bằng hệ dung môi n-hexane: ethylacetate (20:1), thu được
khối chất rắn vô định hình, tách lặp lại trên cột silicagel và kết tinh lại trong n-hexane đã thu được
những tinh thể hình kim, không màu, có khối lượng 23mg, R
f
=0,5, nóng chảy ở 135-136C. Gọi là
H1. Các dữ liệu về phổ NMR đều phù hợp với -sitosterol:

HO
3
5
8
10
12
14 15
17
18
19
20
21
21
22
23
24
25
26
27
28
29

0
10
20
30
40
Lô đc Lô uống
CHe
Lô uống
CEtA
Lô uống
CBuOH
Lô uống
CNC
Nồng độ đường huyết (mmol/l)
0h
3 ngày
7 ngày
10 ngày
20 ngày
Hình 3.12. Tác dụng hạ đƣờng huyết của cao chiết phân
đoạn lá vối

Hình 3.13. Cấu trúc hợp chất -sitosterol
b. -sitosterol-glucopyranoside
Tiếp tục rửa giải cột bằng hệ dung môi n-hexane:ethylacetate (20:1), thu được khối chất rắn
vô định hình, có khối lượng 21mg, gọi là H2. Tiến hành chạy sắc ký bản mỏng với chất chuẩn -
sitosterol-glucopyranoside nhận thấy hai băng chất hoàn toàn trùng nhau cả về vị trí và bắt màu với
chất nhuộm. Chất này là -sitosterol-glucopyranoside :
RO
3
5
8
10
12
14 15
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
R-glucopyranoside





c. 2’,4’-dihydroxy-6’-methoxy-3’,5’-dimethylchalcone
Thay đổi hệ dung môi rửa giải cột theo tỷ lệ n-hexane:ethylacetate (10:1), thu được khối chất
rắn vô định hình, tách lặp lại trên cột silicagel và kết tinh lại trong n-hexane đã thu được những tinh
thể hình kim, màu vàng, có khối lượng 25mg, R
f
=0,7, nóng chảy ở 123-125C. Phân tích các số liệu
phổ cho phép khẳng định H6 là một flavonoid tên 2’,4’-dihydroxy-6’-methoxy-3’,5’-
dimethylchalcon.


OCH
3
HO
OH O
2
3
4
5
6
1'
2'
3'
4'
5'
6'




1





d. 3β-hydroxy-lup-20(29)-en-28-oic acid
Đưa lên cột 15 g CEtA, rửa giải cột bằng dung môi chloroform thu được hợp chất C3 có khối
lượng 41,9 mg là chất rắn vô định hình, màu trắng, có Rf = 0,76, điểm nóng chảy 282 -284
0
C. Kết
Hình 3.14. Cấu trúc hợp chất H2
(-sitosterol-glucopyranoside)
Hình 3.15. Chất H6 tinh sạch và sắc ký đồ bản
mỏng chất H6
Hình 3.16. Cấu trúc H6 (2’,4’-dihydroxy-6’-methoxy-
3’,5’- dimethylchalcon)
hợp các số liệu phổ và tài liệu tham khảo cho phép xác định C3 là 3β-hydroxy-lup-20(29)-en-28-oic
acid (bentulinic acid).













e. Triterpenoid khung olean (3-hydroxy-olean-12(13)en-28-oic acid) Thay đổi hệ dung môi
rửa giải cột chloroform:methanol theo tỉ lệ 9:1 thu được khối chất rắn không màu, có khối lượng
27,2mg, Rf= 0,56, nóng chảy ở 262-263C. Gọi chất này là LVE2. Tất cả các dữ liệu phổ thu được
đã cho phép khẳng định LVE2 là triterpen kiểu khung olean với tên gọi 3-hydroxy-olean-12(13)-
en-28-oic acid.























Hình 3.17. Chất tinh sạch (phải) và xác định cấu trúc C3 (3β-hydroxy-lup-
20(29)-en-28-oic acid) (trái)

Hình 3.18. Sắc ký đồ bản mỏng (phải) và cấu trúc của LVE2
3-hydroxy-olean-12(13)-en- 28-oic acid (trái)




f. 2,3β,23-trihydroxy-urs-12en-28-oic acid
Thay đổi hệ dung môi rửa giải cột bằng hệ chloroform:methanol theo tỷ lệ 80:20 thu được khối
chất rắn vô định hình LVE4 có khối lượng 98,8mg, Rf = 0,75, nóng chảy ở 295-296
0
C. Các số liệu
về phổ của LVE4 cho thấy hoàn toàn phù hợp với phổ của asiatic acid hay 2,3β,23-trihydroxy-urs-
12en-28-oic acid

HO
OH
O
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
HO
HO














g. Hợp chất C7 là một flavonoid (quercetin)
Đưa lên cột 15 g CBuOH, rửa giải bằng hệ dung môi chloroform: methanol tỷ lệ 95:5, thu được
chất kết tinh hình kim màu vàng rơm có khối lượng 15mg, gọi là C7. Hợp chất C7 là một flavonoid
khi so sánh các dữ kiện phổ với các tài liệu thu được đã cho phép kết luận đây là hợp chất quercetin
với công thức phân tử C
15
H
10
O
7
.















3.3.2.4. Thành phần các hoạt chất phân lập được
Trong số 7 hoạt chất phân lập được 2,3β,23-trihydroxy-urs-12en-28-oic acid chiếm tỷ lệ lớn nhất
trong cao phân đoạn (0,66%), tiếp theo là 3β-hydroxy-lup-20(29)-en-28-oic acid (0,28%) và 3-
hydroxy-olean-12(13)-en-28-oic acid (0,185%). Các thành phần còn lại chiếm tỷ lệ trong cao phân đoạn
gần như tương đương nhau, xấp xỉ 0,1%.
3.3.3. Phân đoạn dịch chiết lá chè đắng
3.3.3.1. Khối lượng cao chiết phân đoạn lá chè đắng

Hình 3.19. Sắc ký đồ bản mỏng (phải) và cấu trúc của LVE2 (3-hydroxy-olean- 12(13)-
en- 28-oic acid) (trái)

Hình 3.20. Sắc ký đồ bản mỏng (phải) và cấu trúc hóa học của quercetin (trái)

Xem chi tiết: 01050000474